Layton reçoit une lettre de la célèbre chanteuse d'opéra, Jenis Quatlane, les invitant à voir sa nouvelle performance. Elle demande aussi à Layton, Luke et Rémi de l'aider dans un mystère, disant que son amie Melina est morte il y a un an, mais est revenue plus tard comme une fille de sept ans disant qu'elle avait trouvé le secret de la vie éternelle, et elle connaissait aussi tous les secrets que seule la vraie Melina pouvait connaître. Naturellement, le cas fascine Layton et son apprenti, alors ils vont à l'opéra de la Couronne Petone, mais Rémi reste à Londres, à la recherche de filles qui ont disparu. L'opéra parlait d'un royaume perdu, le Royaume des Immortels; une fois, il y avait une belle reine qui aimait la musique. Elle était aimée de tous dans le royaume. Mais un jour, la reine est tombée très malade. Les gens du royaume ont travaillé pour trouver un remède, mais la médecine ne pouvait pas aider. La reine est finalement décédée, et juste après, le remède a été complété: Une potion pour l'immortalité. Le peuple du royaume se plaignait profondément de la mort de sa reine. Afin de retrouver la reine réincarnée, ils décidèrent de devenir immortels, en utilisant le nostrum d'immortalité juste terminé. Le Royaume d'Abrosia est encore quelque part dans ce monde, attendant que sa reine revienne, et puis, elle chantera pour toujours. Après la fin du spectacle, un homme masqué apparaît et propose quelque chose au public : Jouons à un jeu... Le gagnant, aura la vie éternelle. Les perdants devront mourir. C'est à Layton et Luke d'entrer dans le jeu, et de découvrir le secret de la vie éternelle. A lieu entre les événements des jeux vidéo Professeur Layton et le Dernier Spectre et Professeur Layton et le Masque Miracle.